分子生物學(xué)技術(shù)的又一次進(jìn)階

Nature報道了一項新的技術(shù)——新型核糖體，通過(guò)控制細胞合成蛋白質(zhì)的過(guò)程，讓人們更好地理解蛋白質(zhì)的合成過(guò)程。

核糖體是一種細胞器，細胞利用核糖體轉錄mRNA的信息，從而將氨基酸翻譯成蛋白質(zhì)。試想，如果核糖體被改造，將會(huì )發(fā)生什么？伊利諾斯大學(xué)生化學(xué)家AlexanderMankin與西北大學(xué)生化學(xué)家Michel Jewett 聯(lián)手制造出新型核糖體，并且這種核糖體zui大的優(yōu)勢在于可以根據需要改變其原有的工作方式。

每個(gè)核糖體都是大、小兩個(gè)亞基組成的不規則顆粒，不同的大小亞基有多種結合方式，其可變性也很高。兩位學(xué)者根據這種大小亞基結合的多變性，通過(guò)RNA將大小亞基連接。經(jīng)過(guò)長(cháng)時(shí)間的研究發(fā)現，這種通過(guò)RNA將大小亞基結合的結構可以在細胞內穩定存在數月，并且這種核糖體亞基能夠維持細菌緩慢生長(cháng)，證明這種合成的核糖體亞基與天然的核糖體可并行發(fā)揮作用。

這一發(fā)現開(kāi)啟了分子生物學(xué)的新紀元，在未來(lái)或許可以制造出新型的抗生素。

WesternBlot操作

1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation) 
      使用適當的裂解液裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線(xiàn)粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。

需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度?？梢允褂肂CA蛋白濃度測定試劑盒。
2. 電泳(Electrophoresis) 
(1) SDS-PAGE凝膠配制 
      SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進(jìn)行配制，也可以使用 SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。 
(2) 樣品處理 
      在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。92℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。 
(3) 上樣與電泳 
     冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。  
     電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類(lèi)似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿(mǎn)足要求，為了電泳方便起見(jiàn)，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過(guò)程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定定時(shí)時(shí)間為90－120分鐘。設置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過(guò)頭。
     通常電泳時(shí)溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質(zhì)分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經(jīng)被適當分離后即可停止電泳。
3. 轉膜(Transfer) 
     我們推薦在Western實(shí)驗中選用PVDF膜(FFP36/FFP39)。硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過(guò)程中特別是用鑷子夾取等過(guò)程中容易裂開(kāi)。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。 
     通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，可以設定轉膜電流為300-400mA，轉膜時(shí)間為30-60分鐘。具體的轉膜時(shí)間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時(shí)間越長(cháng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時(shí)間越短。
     在轉膜過(guò)程中，特別是高電流快速轉膜時(shí)，通常會(huì )有非常嚴重的發(fā)熱現象，把轉膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉膜。 
     轉膜的效果可以觀(guān)察所使用的預染蛋白質(zhì)分子量標準，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進(jìn)行染色，以觀(guān)察實(shí)際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀(guān)察蛋白的殘留情況。 
4. 封閉(Blocking) 
     轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。 
     加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉過(guò)夜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 
     參考一抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。 
洗凈封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜?；蚋鼡贵w的說(shuō)明選擇適當的孵育溫度和時(shí)間。
     回收一抗。加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。洗凈洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長(cháng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數。 
 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 
     參考二抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當比例用Western二抗稀釋液稀釋熒光標記的二抗。 二抗需根據一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來(lái)源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過(guò)氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)。洗凈洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。 
     回收二抗。加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長(cháng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數。

7、熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光