鹽析法純化免疫球蛋白原理、步驟及注意事項

原理

蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周?chē)H水基團與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周?chē)乃訙p弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。

材料與儀器

血清
生理鹽水 硫酸銨溶液 萘氏試劑 磷酸鹽緩沖鹽液 磺基水楊酸
冰箱 離心機 攪拌器 紫外分光光度計 扭力天平 粗天平 透析袋 尼龍繩 竹棒、PH試紙 鑷子 剪刀 燒杯 量筒 吸管 滴管 滅菌小瓶 試管

步驟

1. 取正常人混合血清加等量生理鹽水，于攪拌下逐滴加入與稀釋血清等量的飽和硫酸銨[終濃度為50 ％飽和（NH4）2SO4]，4 ℃，3 小時(shí)以上，使其充分沉淀

2. 離心（3000 rpm）， 20 分鐘，棄上清，以生理鹽水溶解沉淀至X ml。再逐滴加飽和硫酸銨X/2 ml，置4 ℃，3 小時(shí)以上［此時(shí)（NH4）2SO4的飽和度為33 ％)］

3. 重復上述第二步過(guò)程多次。將末次離心后所得沉淀物以0.02 M PH7.4 PBS溶解至X ml裝入透析袋。對PBS充分透析、除鹽換液3次，至萘氏試劑測透析外液為無(wú)黃色

4. 將透析袋內樣品取少許作適當倍數稀釋后，以751-G紫外分光光計測蛋白含量。

方法如下

蛋白含量（mg/ml）＝（1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm）×樣品稀釋度。

注：式中1.45與0.74為常數，nm為波長(cháng)。

注意事項

一、影響鹽析的因素

1. 蛋白質(zhì)的濃度

鹽析時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)的濃度對沉淀有雙重影響，既可影響蛋白質(zhì)沉淀極限，又可影響蛋白質(zhì)的共沉作用。蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低，但雜蛋白的共沉作用也隨之增加，從而影響蛋白質(zhì)的純化。故常將血清以生理鹽水作對倍稀釋后再鹽析。

2. 離子強度

各種蛋白質(zhì)的沉淀要求不同的離子強度。例如當硫酸銨飽和度不同，析出的成分就不同，飽和度為50 ％時(shí)，少量白蛋白及大多數擬球蛋白析出；飽和度為33 ％時(shí)γ球蛋白析出。

3. 鹽的性質(zhì)

較為有效的鹽是多電荷陰離子。

4. PH值

一般說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度越大。改變PH改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，也就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。

5. 溫度

鹽析時(shí)溫度要求并不嚴格，一般可在室溫下操作。血清蛋白于25 ℃時(shí)較0 ℃更易析出。但對溫度敏感的蛋白質(zhì)，則應于低溫下鹽析。

6. 蛋白質(zhì)沉淀后宜在4 ℃放3 小時(shí)以上或過(guò)夜，以形成較大沉淀而易于分離。

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