凝膠過(guò)濾層析實(shí)驗（GFC）原理、實(shí)驗步驟及注意事項

原理

分子篩色譜又稱(chēng)凝膠排阻色譜、凝膠過(guò)濾和排阻層析，是 20 展來(lái)的一種新型的液相層析分離純化方法。它的分離基礎主要根據物質(zhì)分子大小不同而進(jìn)行。

分子篩色譜所用的基質(zhì)我們通常稱(chēng)之為好膠，它是具有立體網(wǎng)狀結構且呈珠狀的顆粒物質(zhì)，每個(gè)顆粒猶如一個(gè)篩子，當將混合物樣品加入層析柱進(jìn)行洗脫時(shí)，大分子物質(zhì)不多孔凝膠基質(zhì)能進(jìn)入基質(zhì)內部而沿顆粒間的空隙隨著(zhù)溶劑流動(dòng)，由于其流程較短，移動(dòng)速度快而最先流出柱外;

小分子物質(zhì)則可以進(jìn)入顆粒內部，不斷地在不同的凝膠顆粒間進(jìn)入與逸出，速度較蛋白混合物慢，最后流出柱外;對于中等大小的分子來(lái)說(shuō)，它們既能在凝膠顆粒內外分布，也能部分進(jìn)人顆粒，從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之蛋白質(zhì)按分間被洗脫。

用途

根據蛋白質(zhì)分子量大小和形狀來(lái)分離目的蛋白質(zhì)。

材料與儀器

試劑：
平衡緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4，/NaH2PO4，1.0 mol/L（Nacl（pH7.4）、SDS-PAGE

材料：層析柱、色譜填料

儀器：pH 計、勻質(zhì)機、離心機、蛋白純化儀

步驟

以 100ml 的柱體積實(shí)驗為例

1、先用去離子水將 AKTA 純化儀、柱子沖洗干凈。

2、用 2 個(gè)柱體積 Buffer 平衡柱料。

3、上樣：以流速 1±0.2ml/min 的速度上樣。

4、再用 Buffer 以流速 1±0.2ml/min 的速度進(jìn)行沖洗。

5、在 AKTA 純化儀檢測下，當紫外吸收值開(kāi)始上升時(shí)收集洗脫下來(lái)的目的蛋白，當紫外吸收值下降至不再變化時(shí)停止收集。

6、檢測洗脫液中蛋白濃度,參照考馬斯亮藍法測定蛋白濃度標準操作規程操作，根據洗脫液體積，計算出洗脫液中蛋白量。

7、取樣電泳，參照電泳儀使用標準操作流程。

注意事項

1. 色譜峰對稱(chēng)性差

出峰上升時(shí)，上升緩慢是填料裝填過(guò)緊，而拖尾是因為裝填的太松，此時(shí)對稱(chēng)因子及柱效都很差，出現這種情況就要重現裝柱。裝柱前要了解填料的壓縮系數（壓縮因子）如 Focurose FF 系列的填料的壓縮系數是 1.15，且裝完后要測柱效。

2. 柱床有裂縫或干涸等塌柱現象

檢測管路及柱床體系是否有泄露或氣泡，必要時(shí)重現裝柱。

3. 分離度差

(1) 樣品和選擇的填料不匹配

待分離的樣品中目標物質(zhì)和其它雜質(zhì)的分子量小于 2 倍且都在選擇的填料的排阻極限之外或者之內。若樣品中目標物質(zhì)的分子量和其它雜質(zhì)的分子量小于 2 倍時(shí)，建議嘗試其它方法分離，反之選擇凝膠過(guò)濾層析時(shí)，填料的選擇應根據樣品中目標分子的大小選擇更加接近（大或小都可以）目標分子排阻極限的填料進(jìn)行分離。

(2) 柱床裝填的效果差

通過(guò)測柱效等方式確保柱床裝填的滿(mǎn)足凝膠過(guò)濾層析的過(guò)程。

(3) 上樣量過(guò)大

根據樣品中目標物質(zhì)和雜質(zhì)的分子差異優(yōu)化上樣量，如脫鹽等樣品中目標分子和雜質(zhì)的分子量大于 50 倍時(shí)，上樣量可以達到柱床體積的 25%，最高不超過(guò) 30%，若樣品中目標分子和雜質(zhì)的分子量差異在2-5倍時(shí)，通常上樣量控制在柱床體積的5%以?xún)取?/span>

(4) 流速過(guò)快

凝膠過(guò)濾的過(guò)程流速不宜過(guò)快，降低流速在一定程度上可以提高分離度。

(5) 層析填料被污染或老化

隨著(zhù)填料的使用，一些雜質(zhì)的積累會(huì )使層析填料的孔徑發(fā)生變化（如堵塞，非特異性吸附積累，微生物污染，破碎等），導致其排阻能力發(fā)生偏差而影響分離度。此時(shí)可對填料進(jìn)行 CIP 清洗，若清洗后還不能達到分離要求，就要更換新的填料。

(6) 樣品自身的問(wèn)題

常見(jiàn)問(wèn)題

1、柱填充要均一，決不能出現氣泡。在裝柱時(shí)候要緩慢倒入凝膠，并輕輕敲打柱身趕走氣泡。

2、柱上表面要平，平衡柱時(shí)間要長(cháng)一些，讓凝膠充分沉積為均一的柱床。

3、上樣體積要少，因此最好濃縮樣品。

4、柱床上表面不能干燥，要有 1~2cm 流動(dòng)相覆蓋。

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