離子交換層析實(shí)驗（IEC）原理、實(shí)驗步驟及注意事項

原理

離子交換層析（IEC）用于蛋白質(zhì)分離的原理的是基于帶相反電荷分子間的相互吸引力，其中蛋白質(zhì)表面所帶的電荷取決于蛋白質(zhì) pI 和環(huán)境 pH。蛋白質(zhì)的保留時(shí)間和鹽濃度決定了其與基質(zhì)表面相互作用的結合位點(diǎn)數量。一般在低鹽濃度時(shí)使蛋白質(zhì)結合，而在高鹽濃度時(shí)洗脫蛋白質(zhì)。等度洗脫的洗脫窗口很低，因此通常以線(xiàn)性鹽濃度梯度洗脫蛋白質(zhì)。

用途

根據蛋白質(zhì)表面電荷的不同，分離純化目的蛋白。

材料與儀器

試劑：氯化鈉溶液、平衡緩沖液（20mMTris，pH8.0）、洗脫緩沖液（20mMTris+1MNaCL，pH8.0）、SDS-PAGE

材料：層析柱、色譜填料

儀器：pH 計、勻質(zhì)機、離心機、蛋白純化儀

步驟

一、IEX 分離

將 IEX 介質(zhì)填充到柱中以形成填充床，然后用填充基質(zhì)孔隙和顆粒之間空間的緩沖液平衡床。

二、平衡

1、將固定相平衡到所需的起始條件：當達到平衡時(shí)，所有固定相帶電基團都與可交換的反離子（例如Na+ 或 Cl-）結合。

2、選擇起始緩沖液的 pH 值和離子強度，以確保在上樣時(shí)，介質(zhì)與目標蛋白質(zhì)結合，盡量避免與雜質(zhì)結合。

三、上樣和清洗

1、結合目標分子：樣品緩沖液應具有與起始緩沖液相同的 pH 值和離子強度，以結合所有帶電靶蛋白。帶相反電荷的蛋白質(zhì)與 IEX 介質(zhì)的離子基團結合，集中在色譜柱上。

2、洗掉所有未結合的材料：不帶電荷的蛋白質(zhì)或與離子基團具有相同電荷的蛋白質(zhì)以與緩沖液流速相同的速度通過(guò)色譜柱，在上樣期間或之后洗脫，具體取決于上樣的總體積。

四、洗脫

當所有樣品都已上樣并用起始緩沖液清洗柱子以使所有未結合的蛋白質(zhì)都通過(guò)柱子時(shí)，改變條件以洗脫結合的蛋白質(zhì)。最常見(jiàn)的是，通過(guò)增加緩沖液的離子強度（鹽濃度）或偶爾通過(guò)改變 pH 值來(lái)洗脫蛋白質(zhì)。

注意事項

1、蛋白質(zhì)在低鹽濃度下可能發(fā)生沉淀，所以，在選擇鹽溶液之前，應先評估蛋白質(zhì)復合物在給定鹽溶液中的溶解性。

2、離子交換劑的選擇

必須根據各類(lèi)離子交換劑的性質(zhì)以及待分離物質(zhì)的理化性質(zhì)，選擇一種較為理想的離子交換劑進(jìn)行層析分離。選擇離子交換劑的一般原則如下:

① 選擇陰離子或陽(yáng)離子交換劑，決定于被分離物質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)。如果被分離物質(zhì)帶正電荷，應選擇陽(yáng)離子交換劑；如帶負電荷，應選擇陰離子交換劑；如被分離物為兩性離子，則一般應根據其在穩定性質(zhì)來(lái)選擇交換劑的種類(lèi)。

蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，所帶電荷取決于所處緩沖液的 pH 大小。當蛋白質(zhì)等電點(diǎn)大于其所在緩沖液 pH 時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，應選用陽(yáng)離子交換劑；當蛋白質(zhì)等電點(diǎn)小于其所在緩沖液，蛋白質(zhì)帶負電荷，應選用陰離子交換劑。

② 強型離子交換劑適用的 pH 范圍很廣，所以常用它來(lái)制備去離子水和分離一些在pH 過(guò)高/過(guò)低的溶液中解離且較穩定的物質(zhì)。弱型離子交換劑適用的 pH 范圍狹窄，在 pH 為中性的溶液中交換容量高，用它分離生命大分子物質(zhì)時(shí)，其活性不易喪失。

強酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂雖然可與很多陽(yáng)離子交換，但對正電荷的膠體和高分子陽(yáng)離子都不易吸附或吸附很少，所以一般用弱酸性樹(shù)脂分離堿性蛋白質(zhì)。強、弱型離子交換劑的交換容量與適用 pH 范圍的比較。

③ 離子交換劑處于電中性時(shí)常帶有一定的反離子，使用時(shí)選擇何種離子交換劑，取決于交換劑對各種反離子的結合力。為了提高交換容量，一般應選擇結合力較小的反離子。據此，強酸型和強堿型離子交換劑應分別選擇 H 型和 OH 型；弱酸型和弱堿型交換劑應分別選擇 Na 型和 Cl 型。

④ 交換劑的基質(zhì)是疏水性還是親水性，對被分離物質(zhì)有不同的作用性質(zhì)，如吸附、分子篩、離子或非離子的作用力等。

常見(jiàn)問(wèn)題

1、蛋白質(zhì)在低鹽濃度下可能發(fā)生沉淀，所以，在選擇鹽溶液之前，應先評估蛋白質(zhì)復合物在給定鹽溶液中的溶解性。

2、緩沖液的 pH 對于蛋白質(zhì)結合于 IEX 吸附劑的影響并呈一般性的趨勢，可以影響相互作用的強度。選擇緩沖液的 pH，應該確保蛋白質(zhì)和吸附劑在該環(huán)境下能夠穩定(如避免使用pH過(guò)高/過(guò)低的溶液)。

3、可加少量還原劑或者去污劑防止蛋白聚集。

4、蛋白高鹽洗脫后盡快換至穩定緩沖液中。

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