免疫印跡法（WB）抗體純化的原理、步驟與注意事項

原理

免疫印跡法（Western Blot，WB）是一種通過(guò)識別蛋白質(zhì)的特定抗原性進(jìn)行檢測和分析的方法，可用于抗體純化。在免疫印跡法中，通過(guò)利用蛋白質(zhì)的親和性和特異性，將抗血清中的待純化抗體與其所特異結合的抗原分離出來(lái)。

用途

降低非特異性本底。

材料與儀器

免疫抗原、抗血清、PVDF 膜、電泳膠

電泳液、轉膜液、預染蛋白 Marker

5% 脫脂牛奶、PBST、電泳儀、電轉槽、搖床

步驟

利用 western blot 進(jìn)行抗體純化的步驟如下：

1、上樣蛋白準備。將免疫抗原作為上樣蛋白進(jìn)行備樣，設置 3 個(gè)不同濃度的上樣量（2 ug、4 ug、6 ug），以便后續可通過(guò)不同量的蛋白泳道孵育出的深淺不同驗證抗體特異性。

2、點(diǎn)樣及電泳。根據免疫抗原的分子量大小配置適合的電泳膠（8%～15%），以能明確看到免疫抗原位置為準，進(jìn)行電泳。120 V 恒壓，90～120 min 至藍色指示帶跑到接近膠板下緣。

3、轉膜。先把膠用劃刀裁至合適大小，再根據膠大小裁剪合適的 PVDF 膜，手不要接觸轉膜紙，將毛氈墊、吸水棉分放在夾板兩邊，將膠放在黑色夾板上面，上面覆上 PVDF 膜，趕盡氣泡，夾緊后放入轉膜盒。將整個(gè)轉膜設備放入預先備好的冰塊的盆中。設置條件：350 mA 恒流 90 min。

4、封閉。轉膜結束后，將 PVDF 膜取出放在 5% 脫脂牛奶中封閉 1 小時(shí)。用 PBST 漂洗 3 次，每次 5 min。

5、孵育一抗。這里用抗血清作為一抗進(jìn)行孵育，建議進(jìn)行 1:100 稀釋后使用， PVDF 膜浸潤，搖床 4 ℃ 過(guò)夜。第二天 PBST 漂洗 3 次。

6、孵育二抗。加入 1:3000 稀釋的 HRP 標記的羊抗兔 IgG 二抗將 PVDF 膜充分浸潤，室溫孵育 1 小時(shí)，漂洗 3 次。

7、顯影。將顯影液按比例預先混合好，PVDF 膜平鋪在塑料膜上，蛋白面朝上，將混合好的顯影液均勻地滴在上面。利用 Image Quant LAS 4000 mini 顯影儀顯影。此時(shí)如有蛋白條帶在免疫抗原位置顯示出來(lái)，并根據蛋白量的不同有深淺之分，則說(shuō)明抗血清中抗體滴度高，特異性強。

注意事項

1, 若免疫抗原是自己提純的蛋白，則要保證蛋白的純度，盡可能提高蛋白的純度。

2, 提前搜索目的蛋白的分子量大小，根據分子量大小選擇電泳膠的濃度?？梢詤⒖?marker 說(shuō)明書(shū)，最好讓蛋白跑在膠中間的位置。

3, 轉膜的時(shí)候注意膠和膜的上下關(guān)系，不要轉反，如果轉反了，即便抗體是好用的，實(shí)驗結果也是陰性的。

常見(jiàn)問(wèn)題

1. 免疫抗原一般為人工合成的蛋白，本方法只能說(shuō)明免疫動(dòng)物后產(chǎn)生了抗免疫抗原的抗體，并不能說(shuō)明產(chǎn)生了抗天然蛋白的抗體，如需驗證所產(chǎn)生抗體是否可與天然蛋白結合，需將上樣液中的免疫抗原更換為天然抗原，純度不高沒(méi)有關(guān)系，有一定量即可。

2. 抗血清的稀釋是為了保證所產(chǎn)生的待測抗體滴度足夠高，從而便于后續純化收集，如只想驗證有無(wú)，也可以用抗血清原液進(jìn)行孵育。

3. 如此方法中免疫抗原與抗血清無(wú)法結合，可利用 ELISA 進(jìn)行檢測，因為 WB 中的蛋白為線(xiàn)性蛋白，空間結構與天然有所差別，會(huì )有影響。

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