利用Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法分離純化 IgG1

簡(jiǎn)介

Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法純化 IgG1 是利用在中性 pH 環(huán)境中 Q SepharoseFast Flow 更傾向于結合小鼠腹水中的非目的蛋白，故在用鹽溶液梯度洗脫時(shí)，McAb 會(huì )較早被洗脫或出現在穿過(guò)液中，從而可得到分離純化的 IgG1。

原理

Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法純化 IgG1 的基本原理是 Q Sepharose Fast Flow 為強陰離子交換介質(zhì)，具有流速快（最高流速 750 ml/min）、高量（120 mg HAS/ml）的特點(diǎn)。

小鼠 IgG1 的 PI 范圍為 pH7.0～8.5，而白蛋白和轉鐵蛋白的 PI 范圍為 pH4.7-5.0，因此，在中性 pH 環(huán)境中 Q SepharoseFast Flow 更傾向于結合小鼠腹水中的非目的蛋白。故在用鹽溶液梯度洗脫時(shí)，McAb 會(huì )較早被洗脫或出現在穿過(guò)液中，從而可得到分離純化的 IgG1。

材料與儀器

器材：0.45μm 濾膜、XK 16/20 層析柱，FPLC 層析系統。

試劑：

① Q Sepharose Fast Flow 強陰離子層析分離填料。

② 起始緩沖液：0.02mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH7.5。

③ 洗脫緩沖液：1.0mol/L NaCl-0.02mol/L Tris- HC1 緩沖液，pH7.5。

④ 再生溶液：0.1mol/L NaOH。

步驟

Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法純化 IgG1 的基本過(guò)程可分為如下幾步：

（1）樣品準備

A 小鼠腹水離心去雜質(zhì)，飽和硫酸銨鹽析并除鹽，0.45μm 濾膜過(guò)濾。

（2）分離純化

A 按照 Q Sepharose Fast Flow 生產(chǎn)廠(chǎng)家提供的說(shuō)明書(shū)處理填料，按照 XK 16/20 層析柱使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行裝柱。

B 以 5 ml/min 的流速，用起始緩沖液充分平衡層析柱，至流出液的 pH 值與初始緩沖液相同，約 3 倍層析柱體積，走出一穩定基線(xiàn)。

C 上樣后，采用 2 ml/min 的流速，以 2-3 倍層析柱體積的起始緩沖液洗掉非結合蛋白，即穿過(guò)液中檢測不到蛋白峰。

D 以 5 ml/min 的流速加入洗脫緩沖液，則 NaCl 濃度形成連續梯度，IgG1 將首先被洗脫而流出層析柱。

E 純化的 McAb 可經(jīng)超濾離心管濃縮，BCA 法測定 McAb 蛋白含量，分裝凍存。

F 洗脫結束后，以 5 ml/min 的流速，2-5 倍層析柱體積的再生溶液對層析柱進(jìn)行再生。用初始緩沖液重新平衡層析柱，以備下次使用。

注意事項

1.純化前所有緩沖液、樣品及層析柱都必須平衡至室溫，以避免產(chǎn)生氣泡。

2.純化前樣品、緩沖液須用 0.45μm 濾膜過(guò)濾去除顆粒性物質(zhì)，以防層析柱被堵塞而降低純化效果。

3.不同類(lèi) McAb 的等電點(diǎn)變化范圍較大，即使在同一類(lèi)的不同亞類(lèi) McAb 之間，其等電點(diǎn)也有較大差異（表 1-3）。因此，在純化不同類(lèi)或亞類(lèi)的 McAb 時(shí)，還須進(jìn)行純化條件的優(yōu)化。

4. 為確保層析柱的使用壽命和載量，及時(shí)清洗非常重要，清洗完成后用起始緩沖液重新平衡。

5. 層析柱可于 4℃、20％ 乙醇中長(cháng)期保存。

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