內溶素的克隆、誘導表達與純化

簡(jiǎn)介

作為噬菌體衍生的酶，內溶素本質(zhì)是一種蛋白分子，其通過(guò)分解細菌細胞壁的肽聚糖成分，幫助噬菌體顆粒從細菌宿主釋放，可在噬菌體復制過(guò)程中表達，破壞細菌細胞壁肽聚糖的關(guān)鍵化學(xué)鍵。

原理

通過(guò)內溶素的蛋白表達、純化能夠將內溶素基因克隆到表達載體（如 pET28a），進(jìn)一步轉化大腸桿菌進(jìn)行擴增，重組質(zhì)粒經(jīng) IPTG 誘導表達，得到經(jīng)鎳柱純化的內溶素蛋白。

用途

為治療抗生素耐藥的細菌感染提供潛在解決方案。

材料與儀器

儀器：

離心機、超聲破碎儀

恒溫搖床、恒溫培養箱、PCR 儀、電泳儀

凝膠掃描儀、鎳柱純化系統、0.22 μm 濾膜

試劑：

質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒

核酸內切酶、T4 連接酶、Pfu 聚合酶

IPTG、考馬斯亮藍

步驟

（1）內溶素的克隆

1、引物設計：對待研究的內溶素完成基因組測序注釋工作，根據已測基因組進(jìn)行引物設計 P1 與 P2，并引入酶切位點(diǎn)。

2、PCR 擴增內溶素基因：反應體系與程序見(jiàn)表 1。

3、PCR 反應條件：95 ℃ 預變性 5 min，95 ℃ 變性 30 s，Tm 溫度下退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 最后延伸 10 min，26 ℃ 再反應 2 min（終止反應）。

4、回收 PCR 產(chǎn)物膠：進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將 50 μL 全部上樣，切下目的基因條帶，使用膠回收試劑盒回收目的基因（一般實(shí)驗室都會(huì )有常用品牌）。

5、抽提質(zhì)粒：使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提載體質(zhì)粒（一般實(shí)驗室都會(huì )有常用品牌）。

6、對位點(diǎn)進(jìn)行酶切：利用一開(kāi)始設計好的酶切位點(diǎn)對載體與目的基因進(jìn)行雙酶切，在 37 ℃ 下反應 3 h。

7、切膠回收：將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取含 DNA 片段的目的條帶并進(jìn)行回收，得到 DNA 后檢測其濃度并保存在 -20 ℃ 冰箱備用。

8、DNA 與載體連接：用 T4 連接酶連接載體與 DNA 片段，在 16 ℃ 下過(guò)夜。

9、轉化大腸桿菌：取 50 μL 大腸桿菌 BL21 感受態(tài)細胞，加入 5 μL 連接液后冰上孵育 30 min，搖勻后 42 ℃ 水浴熱休克 90 s，然后迅速冰浴 2 min，冰浴后再加入已經(jīng)預熱的 1 mL LB 培養基，37 ℃ 搖床震蕩 1 h 復蘇，最后涂板至卡那霉素抗性的平板，37 ℃ 溫度下培養過(guò)夜。次日挑取單菌落進(jìn)行菌落 PCR，將陽(yáng)性菌落接種于培養基中 37 ℃ 溫度下培養過(guò)夜。

10、抽提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗證（參見(jiàn) 5、6 步）。

（2）內溶素的表達與純化

1、少量誘導表達：挑選單菌落過(guò)夜培養，過(guò)夜菌接種至 1 mL 培養基，37 ℃ 培養 2~3 h，再加入 10 μL 0.1 M 的 IPTG 在 16 ℃ 誘導 4 h，取 20 μL 菌液加入 7.5 μL 的蛋白緩沖上樣液，100 ℃ 沸水煮 10 min 后電泳，倒入考馬斯亮藍過(guò)夜震蕩，清洗后尋找發(fā)現目標蛋白條帶存在，進(jìn)一步擴大培養。

2、擴大培養：將陽(yáng)性菌落涂布平板過(guò)夜，挑選單菌落接種至 10 mL 培養基，37 ℃ 培養 6 h，按  1:100 比例接種于 500 mL 培養液中，37 ℃ 搖床至 OD600 值為 0.6~0.8，加入終濃度為 1 mM 的 IPTG 誘導劑，在 16 ℃ 下繼續培養 12 h。

3、細胞破碎：菌液離心 10 min（4000 g，4 ℃），重懸于 30 mL PBS，加入 PMSF 和 tritonX-100 冰浴 1 h 后超聲破碎，破碎菌液在 4 ℃ 轉入 50 mL 離心管，12000 rpm 離心10 min，取上清液用 0.22 μm 濾膜過(guò)濾雜質(zhì)。

4、蛋白純化：采用 Ni-NTA 純化系統進(jìn)行鎳柱親和層析純化目的蛋白，純化后跑電泳，分析蛋白純度。

注意事項

1. PCR 條件與程序需要根據實(shí)驗進(jìn)行梯度摸索。

2. T4 連接酶在高溫不穩定，通常 16 ℃ 連接過(guò)夜，在 25 ℃ 左右的室溫能維持七八個(gè)小時(shí)。

常見(jiàn)問(wèn)題

蛋白誘導表達效果不好（蛋白誘導表達條件并不一定適用所有實(shí)驗室，需要自己做實(shí)驗摸索條件）。

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