刀豆素 A 親和柱純化蛋白質(zhì)的原理、步驟及注意事項

原理

用于親和層析的凝集素應根據它們結合的特異性和緊密度加以選擇。例如，刀豆素 A（Con A）與糖蛋白含有的葡萄糖或甘露糖結合，而麥芽凝集素只與具 N-乙酰葡糖胺的蛋白質(zhì)結合。胞膜糖蛋白常與麥芽凝集素結合，而可溶性糖蛋白卻通常用 Con A 或扁豆凝集素親和柱純化。由于在許多情況下被純化的糖蛋白的結構和特性不清楚，所以篩選一些凝集素與目的蛋白的結合狀況常常是有用和必要的。用于此目的的凝集素試劑盒也可購得。

凝集素親和層析相對易于操作?？捎迷S多方法將凝集素固相化到介質(zhì)。溴化氰偶聯(lián)是普遍采用的方法。每 ml 介質(zhì)材料能偶聯(lián)凝集素。偶聯(lián)時(shí)含有適宜的二價(jià)離子（0.1 mmol／L）和保護性糖類(lèi)（5％，w／v）是關(guān)鍵。保護性糖類(lèi)在偶聯(lián)過(guò)程中使結合部位不易接近而受到保護。許多凝集素親和柱也可從市場(chǎng)購得。

以下步驟以介紹刀豆素 A 親和柱純化蛋白質(zhì)為例，其他凝集素親和柱的純化步驟基本相似，只要換成適宜的洗脫用糖。相對長(cháng)而細的層析柱有更好的分辨率，短而粗的柱子在小體積洗脫時(shí)具有更快的流速。小的試驗柱（例如裝填在巴斯德吸管內的）或在小離心管內進(jìn)行的層析試驗可用于估算柱的結合容量。

材料與儀器

糖蛋白樣品液
甲基-α-D-甘露糖 NaCl NaN3 Tris-HCl NaCl Mncl2 CaCl2 辛糖苷
層析柱

步驟

1. 制備刀豆素 A 親和柱；

2. 用 10 倍柱體積的層析緩沖液（20 mmol／L ，pH 8.0 Tris-HCl，0.15 mol／L NaCl，1 mmol／L MnCl2，1 mmol／L CaCl2，30 mmol／L 辛糖苷）平衡裝好的親和柱；

3. 糖蛋白樣品液對層析緩沖液透析或用該緩沖液 1：1稀釋?zhuān)缓箅x心或過(guò)濾除去沉淀；

4. 將調整好的糖蛋白樣品液上樣到親和柱；

5. 用層析緩沖液洗柱至 A280 值回到基線(xiàn)；

6. 用 5 倍柱體積含10 mmol／L 甲基-α-D-甘露糖的層析緩沖液洗脫；

7. 繼續分別用 5 倍柱體積含 20、50、100、250和 500 mmol／L 甲基-α-D-甘露糖的層析緩沖液洗脫；

8. 檢測目的蛋白組分。匯集的目的蛋白組分透析除去糖；

9. 用含 1 mol／L NaCl 的層析緩沖液洗柱，以獲得再生；

注意事項

一些凝集素在它們的結構整合中需要某些二價(jià)離子。因為凝集素親和層析常常涉及膜蛋白質(zhì)，故經(jīng)常需要去垢劑以保持這些蛋白質(zhì)的可溶性。雖然凝集素對非離子型去垢劑相當寬容，但是離子型去垢劑減少它們的特異結合。

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